本試劑盒用于革蘭氏陽性（G+）xi菌小量制備質(zhì)粒 DNA 。本產(chǎn)品基于改良后的堿 變性法，首先菌體經(jīng)溶菌酶破壁，然后菌體經(jīng)堿裂解、高鹽、低 pH 處理，質(zhì)?？蓮木w 中釋放出來，并特異、高效地被離心吸附柱吸附。通過清洗液的洗滌可去除雜質(zhì)，在低 鹽、高 pH 條件下洗脫，得到純度較高的質(zhì)粒 DNA。使用本試劑盒每次可處理 1- 4 ml 過夜培養(yǎng)的菌液，所得質(zhì)粒可直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、測序及轉(zhuǎn)染等各種分子生物學 實驗。
它具有下列特點：
1. 快捷、高效：操作簡便，得率高，節(jié)約時間；
2. 純度高：沉淀致密，去雜干凈。約時間。
成分規(guī)格
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Buffer S1
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15ml
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30ml
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60ml
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Buffer S2
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15ml
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30ml
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60ml
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Buffer S3
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25ml
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50ml
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100ml
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Buffer EB
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10ml
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10ml
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30ml
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Buffer W2（concentrate）
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15ml
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30ml
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60ml
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RNase A (10 mg/ml)
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150μl
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300μl
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600μl
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溶菌酶干粉（20 KU /mg）
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300mg
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550mg
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1.1g
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Spin Column with Collection Tubes
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50套
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100套
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200套
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注意：使用前將全部 RNase A 溶液加到 Buffer S1 中混合均勻，2 - 8℃保存;按要求在 Buffer W2 中加入無水乙醇
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本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于其它用途
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保存條件
在室溫(15-25℃)干燥條件下，可保存 12 個月；更長時間的保存可置于 2-8℃ 。若溶 液產(chǎn)生沉淀，應(yīng)在使用前置于37℃下溶解沉淀。加入 RNase A 后的 Buffer S1 應(yīng)置于 2-8℃ 保存，可穩(wěn)定保存 6 個月。
1. 從篩選平板上挑取單菌落至含抗生su的培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng) 12-16 小時（搖 床轉(zhuǎn)速 200-300）。
(注 意：建議使用 LB 培養(yǎng)基，營養(yǎng)更豐富的培養(yǎng)基會使菌體濃度過高，超過純化系統(tǒng)處理能力而降 低 DNA 質(zhì)量。另外，延長培養(yǎng)時間會因xi胞死亡、裂解而造成質(zhì)粒 DNA 濃度降低。)
2. 用 1.5 mL 離心管收集 1-4 mL 過夜培養(yǎng)飽和菌液，室溫 12,000 rpm 離心 1 分鐘，棄上清。
(一次使用本試劑盒時，先將全部 RNase A 溶液全部加入到 Buffer S1 中，搖勻后再取用，未用完的溶液放 4℃保存。)
3. 加入 250 uL Buffer S1 ，旋渦震蕩或用槍頭充分吹打使菌體重懸。加入大約 5 mg 溶 菌酶干粉，輕柔顛倒混勻后室溫放置 10 min 破裂xi胞壁。
（注意：菌體沉淀一定要懸浮均勻，如有未徹底懸浮的菌塊會影響裂解，導(dǎo)致提取的質(zhì)粒濃度及純度 降低）
4. 加入 250 μl Buffer S2 ，溫和顛倒混勻使菌體完全裂解，直到溶液變成清亮、粘稠。
（注意：不可劇烈震蕩， 以免造成基因組 DNA 片段的污染）
5. 加入 350 μl Buffer S3，立即顛倒混勻，可見絮狀沉淀物產(chǎn)生，然后 12,000 rpm 離心 3 min。
（注 意：Buffer S3 加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀）
6. 將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中，12,000 rpm 離心 30 sec ，棄收集管中濾液。
7. 加入 600 μl Buffer W2 ，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec ，棄收集管中濾液。
（注 意：Buffer W2 為濃縮液，按要求加入無水乙醇，用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋， 以防酒精揮發(fā)）
8. 加入 500 μl Buffer W2 ，室溫 12,000 rpm 離心 30 sec ，棄收集管中濾液。
9. 干燥。將離心吸附柱于 12,000 rpm 離心 2 min ，甩干殘留漂洗液。
（注 意：此步不能省略，否則殘留乙醇會影響質(zhì)粒的后續(xù)使用）
10. 將吸附柱置于一新的無菌 1.5 ml 離心管（自備）中，加入 50-100 μl 的洗脫液 Buffer EB，室溫 12,000 rpm 離心 1 min ，離心管底溶液即質(zhì)粒 DNA。
（注 意：為增加洗脫效率，可將洗脫液在60℃預(yù)熱。如需使用去離子水洗脫，可用NaOH 調(diào)整其pH 值在 7.0 - 8.5之間，為了增加質(zhì)?；厥章剩蓪⒌玫降娜芤褐匦录尤氲诫x心管中，室溫放置 2 min，再次離心收集）
注意事項
1. xi菌培養(yǎng)時間一般為 12-16 小時，如接種量大則應(yīng)減少培養(yǎng)時間，過度培養(yǎng)會降低質(zhì)粒 質(zhì)量甚至導(dǎo)致質(zhì)粒 DNA 突變。
2. 每次使用時都要注意 Buffer S2 和 S3 是否形成沉淀，如有沉淀 37℃溶解后再用。
3. 質(zhì)粒的產(chǎn)量跟xi菌量、質(zhì)?？截悢?shù)、質(zhì)粒大小和操作規(guī)范程度密切相關(guān)。
